Kromatografi

5. Kromatografi
Kromatografi adalah proses pemisahan yang digunakan untuk memisahkan campuran molekuler berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen dan distribusi molekul-molekul dalam dua fasa diam (adsorben) dan fasa bergerak (eluen). Dengan perkataan lain prinsip dasar dalam analisa kromatografi adalah berdasarkan pada prinsip distribusi fasa yakni suatu perpindahan komponen-komponen zat yang dianalisa dari suatu fasa yang bergerak (eluen) menuju ke fasa lain yang diam (adsorben) yang dilaluinya. Eluen adalah pelarut yang dipakai dalam proses migrasi/pergerakan dalam membawa komponen-komponen zat sampel atau fasa yang bergerak melalui fasa diam dan membawa komponen-komponen senyawa yang akan dipisahkan. Sedangkan adsorben adalah fasa diam yang mengikuti/menyerap zat yang dianalisa, contohnya kertas, kanji, selulosa, silika gel, dll. Distribusi fasa atau perpindahan molekul suatu komponen dari fasa yang bergerak menuju ke fasa diam yang dilaluinya merupakan suatu proses kesetimbangan. Apabila tetapan kesetimbangan dari molekul komponen-komponen dari zat yang akan dianalisa terhadap ke dua fasa yang bergerak dan fasa diam yang dilaluinya berbeda, maka akan terjadi pemisahan komponen-komponen tersebut. Bila suatu komponen mempunyai daya ikat pada fasa diam yang dilaluinya lebih besar, maka komponen tersebut akan lebih dahulu terikat/diadsorbsi oleh fasa padat daripada komponen yang lainnya. Sebagai hasil analisa kromatografi, daerah pemisahan komponen pada fasa diam akan berupa pita lurus.
Distribusi molekul dapat berupa distribusi fasa adsorbsi dan distribusi fasa partisi. Distribusi fasa adsorbsi yaitu distribusi fasa yang terjadi karena adanya perbedaan daya adsorbsi komponen-komponen pada fasa padat. Sedangkan distribusi fasa partisi yaitu distribusi fasa yang terjadi karena perbedaan kelarutan komponen-komponen dalam pelarut-pelarut yang tidak saling melarutkan. Kromatografi dapat digunakan untuk sbb:
1. Menentukan konsentrasi suatu zat sampel.
2. Menentukan kemurnian zat sampel.
3. Memisahkan komponen-komponen yang terdapat dalam suatu zat.
4. Menentukan komponen-komponen yang terdapat dalam suatu zat sampel dengan menghitung harga Rf (Ratio formation) tiap komponen.

Rf = Jarak titik awal ke titik noda dibagi Jarak titik awal ke titik akhir pergerakan eluen

Dengan demikian menurut gambar di atas, Rf = a/b. Harga Rf dipengaruhi oleh keadaan zat sampel, temperatur, dan jenis komponen.
Keakuratan hasil pemisahan dengan kromatografi bergantung pada beberapa faktor sbb:
a. Pemilihan adsorben sebagai fasa diam.
b. Kepolaran pelarut atau pemilihan pelarut yang sesuai dengan fasa gerak.
c. Ukuran kolom (panjang dan diameter) relatif terhadap jumlah material yang akan dipisahkan.
d. Laju elusi atau aliran fasa gerak.
Analisa kromatografi dapat dibagi menjadi kromatografi kertas, kromatografi gas, kromatografi lempeng tipis, dan kromatografi kolom.

a. Kromatografi kertas
Adalah kromatografi atau pemisahan komponen-komponen zat dari campuran berdasarkan distribusi partisi cair-cair. Pada analisa kromatografi kertas, molekul komponen sebagian terdistribusi dalam zat cair yang polar yakni air yang mudah teradsorpsi oleh kertas, dan sebagian komponen terdistribusi dalam eluen yang akan mengalir naik ke ujung kertas bagian atas. Komponen-komponen suatu senyawa yang akan dianalisa dapat dipisahkan dan dibedakan dengan harga Rf-nya. Bagian-bagian yang mudah terdistribusi dalam air akan cepat teradsorpsi oleh kertas dan perjalanan/migrasinya lebih pendek. Sedangkan bagian-bagian yang tidak terdistribusi dalam air, melainkan dalam eluen, maka akan terus mengalir ke atas dan perjalannya lebih jauh, dengan perkataan lain Rf-nya lebih besar daripada bagian yang sebelumnya yang perjalanan/migrasinya lebih pendek. Noda-noda komponen yang terdapat dalam senyawa yang dianalisa akan berderet ke atas pada satu garis atau pita lurus. Eluen dibiarkan naik sampai mendekati pinggiran atas dari kertas, kemudian diberi tanda dengan garis.
Kromatografi kertas dapat digunakan untuk keperluan identifikasi (analisa kualitatif, seperti untuk analisa tinta), penetapan kadar zat (analisa kuantitatif), pemurnian senyawa (pekerjaan preparatif), untuk menganalisa asam-asam amino yang terdapat dalam suatu protein.
Cara melakukan percobaan kromatografi kertas sbb:
Gunting kertas kromatografi berukuran 1,5 x 12 cm (sesuai dengan tabung kromatografi yang tersedia), lubangi salah satu ujungnya untuk menggantungkan penyangga. Beri tanda garis kurang lebih 1 cm dari ujung kertas bagian bawah dengan pensil. Teteskan zat sampel yang akan diperiksa komponennya pada garis batas tersebut dengan menggunakan bantuan pipa kapiler, keringkan dan ulangi penetesan ± 3x. Pasang tabung kromatogram (tabung reaksi besar) pada statif seperti gambar di bawah ini.

Selanjutnya isi dengan eluen yang sesuai dengan komponen yang akan dipisahkan (cari dalam textbook atau handbook). Ingat dinding tabung tidak boleh basah. Masukan kertas kromatogram tersebut ke dalam tabung kromatogram, atur penyangga sehingga kertas kena eluen (eluen tidak boleh kena pada noda). Biarkan eluen naik sampai mendekati ujung kertas kromatogram, kemudian angkat dan beri tanda batas akhir eluen, lalu keringkan. Apabila noda yang dihasilkan belum jelas semprot dengan pereaksi yang cocok. Hitung Rf-nya dan tentukan berapa komponen yang terdapat dalam zat sampel.

b. Kromatografi lempeng tipis (KLT)
Adalah kromatografi atau pemisahan komponen-komponen zat dari campuran berdasarkan pada jenis distribusi fasa adsorbsi cair-padat. Sebagai fasa padat atau adsorbennya berupa lapisan tipis bubur alumina atau silika gel yang menempel pada permukaan selembar lempengan kaca atau selembar plastik kaku. Sedangkan sebagai fasa cairnya ialah eluen yang digunakan untuk membawa zat yang akan diperiksa bergerak melalui fasa padat. KLT digunakan untuk menganalisa suatu senyawa, untuk mengetahui komponen-komponen senyawa tersebut dengan menghitung Rf komponen-komponen yang ada. Disamping itu dapat juga digunakan untuk menentukan eluen yang paling cocok bagi suatu senyawa dalam kromatografi kolom.

Cara membuat lempeng tipis:
1. Cuci lempeng kaca (slide mikroskop) dengan air sabun, kemudian dengan metanol, keringkan. Campurkan 35 gram silika gel dan 1 gram kanji, haluskan dan aduk sampai merata, kemudian masukan ke dalam 100 ml kloroform-metanol (2:1) dalam botol tertutup, aduk sampai merata. Ambil 2 buah slide yang dipegang dalam posisi saling berhimpitan, kemudian masukan slide itu ke dalam suspensi tersebut, tariklah pelan-pelan, biarkan mengering dan bila sudah cukup kering maka pisahkan ke dua slide dan letakan perlahan-lahan.
2. Buat bubur aluminium atau silika gel yang dicampur dengan kanji (kalsium sulfat) dan air, dengan perbandingan 30:1:65, aduk sampai merata. Pasang slide pada alat seperti di bawah ini.

Tuangkan campuran ke atas slide tersebut, ratakan dengan menggunakan batang pengaduk. Ambil slide tersebut, letakan dan biarkan mengering secara perlahan-lahan. KLT tersebut sebelum digunakan panaskan terlebih dahulu pada suhu 1100C selama ±15 menit.

Cara melakukan percobaan KLT:
Letakan KLT di atas kertas yang telah diberi gambar KLT dengan tanda garis ± 1cm dari bagian bawah. Teteskan zat sampel dengan pipa kapiler di atas garis tersebut, keringkan, ulangi penetesan 3x. Masukan KLT ke dalam gelas kimia yang berisi eluen dan pinggirannya telah dilapisi kertas saring, tutup gelas kimia dengan gelas arloji (noda tidak boleh kena pada eluen). Biarkan eluen naik sampai mendekati ujung kertas KLT, kemudian angkat dan letakan kembali di atas kertas seperti langkah pertama. Beri tanda pada kertas batas akhir eluen, keringkan. Apabila noda tidak jelas semprot dengan pereaksi yang cocok. Kemudian letakan kembali di atas kertas. Beri tanda letak noda pada kertas tersebut. Tentukan banyaknya komponen dan hitung Rf masing-masing noda. Perhatikan gambar di bawah ini.